PENDIAGNOSAN MAKMAL PARASIT MALARIA (PENCELUPAN)

PENCELUPAN MALARIA

1.                    Pencelupan field iaitu terbahagi kepada pencelupan field cara cepat dan cara lambat.

2.                    Pencelupan giemsa. Juga terbahagi kepada pencelupan cara cepat dan pencelupan cara lambat.

PENYEDIAAN PENCELUP

PENCELUP FIELD

Pencelup A   : methelene blue, medicinal          0.8g

                          Azure I                                             0.5g

                          Disodium hydrogen phosphate  5.0g

                          Na₂HPO₄ anhydrous                    

                          Potassium dehydrogen phosphate

                          KH₂PO₄                                            6.25g

                          Air suling                                         500ml

Larutkan garam sodium dan potassium dalam air suling dengan mengacaunya dengan menggunakan pengacau kaca. Masukkan methulene blue dan larutan Azure I yang pada mulanya telah digilingkan dengan sedikit larutan phosphate dalam mortar, sebelum disebatikan.

Pencelup B   :  Eosin, kuning, larut air    1.0g

                          Na₂HPO₄ anhydrous         5.0g

                          KH₂PO₄                                6.25g

                          Air suling                             500ml

Larutkan garam fosfat dalam air suling dan campurkan eosin sebelum disebatikan dengan pengacau kaca.

Pencelup-pencelup ini mesti disimpan dalam botol pyrex dan dibiarkan ‘masak’ selama 24 jam. Kemudian pencelup ini dituras sebelum digunakan.

LARUTAN TAMPAN FOSFAT UNTUK PENCELUPAN MALARIA

                        Disodium hydrogen fosfat (Na₂HPO₄) anhydrous        1.0g

                        Potassium dihidrogen fosfat (KH₂PO₄)                           0.7g

                        Air suling                                                                               1000ml

Ini ialah larutan tampan hipotonik dengan pH 7.2. larutan ini digunakan dalam pencelupan Malaria. pH yang tepat akan memberikan tindakbalas pencelupan Romanosky yang baik. Kebanyakan sifat-sifat yang sangat penting untuk menentukan malaria dalam filem darah, akan dipertunjukkan dengan jelas dalam pH 7.0- 7.2. Uji pH larutan tampan ini sebelum digunakan.

PENCELUP GIEMSA

                        Serbuk giemsa (Revector)             3.8g

                        Glycerol (Analar)                              250ml

                        Methanol (Analar)                            250ml

Gilingkan dengan bersungguh-sungguh serbuk pencelup kedalam mortar gelas. Tambahkan glycerol perlahan-lahan sambil gilingkan dan sebatikan pasa setiap tambahan. Tuangkan lebih kurang setengah isipadu methanol yang telah disukat ke dalam mortar dan gilingkan

Pindahkan pencelup ini kedalam botol gelap yang bersih. Tambahkan setengah isipadu methanol yang tetinggal ke dalam mortar, giling dan sebatikan sisa pencelup yang tertinggal

Biarkan pencelup ini ‘masak’ selama 2-3 hari pada suhu 37°C dan mesti digoncang 6-10 kali setiap hari sehingga bahan ini larut. Turaskan pencelup dan simpan didalam ‘drop bottle’ sebelum digunakan.

PENCELUP GIEMSA- CARA WALKER

Sediakan flask Erlenmayer (Pyrex) yang bersih atau botol yang sesuai dengan 50 bijian gelas yang berdiameter 5mm

1.    Biji-bijian gelas dibasuh engan methanol dan dibiarkan kering

2.    Bijian gelas kemudiannya dimasukkan kedalam flask, kemudian basuh sekali lagi cengan methanol.

3.    Isipadu methanol (Analar, bebas aceton)yang telah disukat dituangkan kedalam flask yang telah disediakan dan masukkan serbuk giemsa(Revector).

4.    Flask ditutup ketat dan serbuk giemsa dibiarkan tenggelam dengan perlahan-lahan hingga ke bawah flask.

5.    Flask digoncang secara bulatan selama 2-3 minit.

6.    Glycerol ditambah (Analar) dan proses goncangan diulang. Goncang pada setiap 30 minit, sekurangnya 6 kali.

7.    Eram pada suhu 37°C selama 24 jam dan goncang dari semasa ke semasa.

8.    Pencelup tersebut dituran dann disimpan dalam ‘drop bottle’ untuk digunakan

CARA PENCELUPAN UNTUK FILEM DARAH NIPIS MALARIA

PENCELUPAN FIELD (CARA CEPAT)

1.    Filem darah nipis difixkan dengan methanol selama 30 saat

2.    Slaid dibasuh dalam air untuk menghilangkan methanol dan dimasukkan kedalam pencelup B selama 3 saat.

3.    Ia dibasuh sekali lagi dala air untuk tempoh beberapa saat.

4.    Slaid kemudiannya dimasukkan kedalam air untuk beberapa saat

5.    Basuh dengan air

6.    Slaid ditegakkan diatas rak slaid untuk mengeringkannya dan periksa di bawah mikroskop.

PENCELUPAN GIEMSA (CARA LAMBAT)

1.    Filem darah nipis dibiarkan kering dan difixkan dengan methanol selama 30 saat

2.    Larutan pencelup 10% Giemsa disediakan dengan larutan tampan fosfat pH7.2 sambil menunggu filem darah nipis ini kering.

3.    Pencelup Giemsa cair ini kemudiannya dituangkan ke atas filem tersebut dan biarkan pencelupan selama 20 minit.

4.    Slaid dibaruh dengan air yang berarus.

5.    Slaid dibiarkan kering dan diperiksa dibawah mikroskop.

PENCELUPAN UNTUK FILEM DARAH TEBAL MALARIA

PENCELUPAN FIELD (CARA CEPAT)

1.    Filem darah tebal dibiarkan kering sama ada dibiarkan dalam ‘slide tray’ atupun dibiarkan di bawah cahaya matahari selama 3-5 minit.Inkubator bersuhu 37°C juga boleh digunakan.

2.    Slaid dimasukkan ke dalam pencelup A selama 3 saat.

3.    Slaid kemudia dibasuh dengan perlahan lahan dalam air selama 10 saat,

4.    Slaid kaca direnjiskan untuk meghilangkan air yang berlebihan.

5.    Slaid kemudian dimasukkan kedalam pencelup B selama 1 saat.

6.    Kemudia basuh seperi langkan 3 selama 10 saat.

7.    Slaid dibiarkan kering pada suhu bilik. Jangan gunakan incubator atau pemanas udara ‘hair dryer’

PENCELUPAN GIEMSA (CARA LAMBAT)

1.    Filem darah dibiarkan kering.

2.    Larutan pencelup 10% giemsa dengan larutan tampan fosfat pH 7.2 disediakan semasa menunggu filem darah untuk kering.

3.    Slid diletakkan diatas 2 batang keluli gelas dan pencelup Giemsa cair dituangkan keatasnya. Slaid dibiarkan selama 10 minit.

4.    Perlaha-lahan baruh dengan air bersih selama 10 saat.

5.    Slaid dibiarkan kering dan diperiksa dibawah mikroskop.

PEMERIKSAAN MIKROSKOP

PEMERIKSAAN FILEM DARAH NIPIS

Memandangkan pemeriksaan bagi filem darah nipis adalah 10 kali ganda lebih panjang daripada pemeriksaan untuk filem darah tebal, pemeriksaan sebagai rutin adalah tidak digalakkan kerana hanya sedikit slaid yang boleh dibaca dalam sehari kerana tempoh masa yang panjang untuk melakukan pemeriksaan keatas filem darah nipis ini.

Walau bagaimanapun, pemeriksaan filem diperlukan dalam keadaan berikut :

·         Kesukaran  untuk memeriksa filem darah tebal  kerana morfologinya telalu kecil, atau juga disebabkan autofiks

·         Apabila perlu untuk konfirmasikan spesies

Apabila pemeriksaan filem darah nipis dilakukan, kaedah standad perlu dilakukan seperti:

1.    Petakkan slaid keatas pentas mekanikal mikroskop

2.    Letakkan pada posisi kanta 100X dengan diletakka setitis oil immersion.

3.    Periksan filem darah bedasarkan pergerakan yang ditujukkan pada gambarajah dibawah. Iaitu slaid digerakkan sepanjang filem darah dalam keadaan vertical atau horizontal dan kembali kepada pergerakan lateral . langkah ini diulang.

4.    Teruskan memeriksa sehingga 100 field samaada filem darah adalah positif atau negetif bagiu infeksi malaria

Gambarajah pemeriksaan filem darah nipis (sama aga secara vertical atau horizontal tapi dala keadaan selari)

PEMERIKSAAN FILEM DARAH TEBAL

Pemeriksaan filem darah tebal dilakukan adalah sebagai proses penyaringan keatas sampel darah sama ada positif malaria atau negatif malaria. Spesies malaria yang terinfeksi tidak dapat diketahui perbezaan morfologi malaria dalam filem darah tersebut telah berubah. Filem darah tebal ini juga diperiksa bagi 100  field.

Teknik bagi pemeriksaan filem darah tebal adalah :

1.    Dengan menggunakan kanta objektif 40X, imbas keseluruhan filem darah sama ada terdapat parasit malaria. Dalam masa yang sama, pilih kawasan yang tercelup dengan baik iaitu bebas skum, SDP dan lain-lain.

5.    Titiskan oil immersion pada filem darah tebal tersebut dan lihat dibawah kanta 100X dan lakukan pemeriksaan dengan slaid digerakkan sepanjang filem darah dalam keadaan vertical atau horizontal dan kembali kepada pergerakan lateral . langkah ini diulang.

6.    Gunakan tally counter untuk melakukan pembilangan parasit dalam 100 field.

Pemeriksaan filem darah tebal.